À cause des maladies et de l'épuisement physique, François passa ses dernières années dans de grandes souffrances. Cependant, il conserva toujours une attitude de sérénité, d'espérance et de confiance en Dieu. 

Il mourut le 3 octobre 1226 à la Portioncule, près d'Assise, entouré de ses frères. Les franciscains appellent ce moment le « trépas » (Transitus), car ils considèrent que ce fut le passage définitif vers la vie éternelle.